Cultivo de células y la agrupación de anoxia cerebral

Abstracto

Para examinar los efectos neuroprotectores de ginsenósidos R0, se investigaron los efectos de ginsenósidos R0 en células PC12 bajo un ambiente anóxico o oxidativo con edavarona como control. Se utilizaron células neuroendocrinas PC12 como una diana modelo. Anóxico daño o el daño oxidativo en las células PC12 fueron inducidos mediante la adición de ditionito de sodio o peróxido de hidrógeno, respectivamente, en medio de cultivo. relaciones de supervivencia de los diferentes grupos se detectaron mediante un ensayo alamarBlue. Al mismo tiempo, la apoptosis de las células PC12 se determinó con citometría de flujo. Los efectos neuroprotectores putativos de ginsenoside R0 se cree que está ejercida mediante el aumento de la actividad de las enzimas antioxidantes superóxido dismutasa (SOD) .Brain anoxia


la actividad de SOD y el nivel de malondialdehído (MDA) y especies reactivas de oxígeno intracelulares (ERO), se midieron para evaluar los efectos protectores y terapéuticos de ginsenoside R0. Ginsenosido R0 células tratadas tenían una actividad SOD mayor, menor nivel de MDA y menor ROS, y su tasa de supervivencia fue mayor con una tasa de apoptosis inferior. Se sugiere que ginsenoside R0 tiene un efecto protector en las células PC12 cultivadas, y la eficacia de la protección es mayor que edaravona. Los mecanismos de protección de estos dos son diferentes. Prevenir la capacidad de ginsenósidos R0 es mayor que su capacidad de reparación en la neuroprotección in vitro. Palabras clave: ginsenoside R0, edavarona, daño anóxico, daño oxidativo, las células PC12

anoxia cerebral

INTRODUCCIÓN

El ginseng, de donde se extraen los ginsenósidos, es la raíz de ginseng PANAC, y se ha utilizado en Asia durante más de 2000 años como un tónico en la medicina tradicional china. saponinas aisladas de ginseng ginseng habían sido considerados como los principales componentes responsables de las actividades biológicas. Hasta ahora, más de 40 ginsenósidos diferentes habían sido identificados (keum et al., 2000). Ginsenósidos han sido conocidos por causar varios efectos fisiológicos posibles, incluyendo la estimulación del sistema nervioso central, aumentando el rendimiento de aprendizaje inicial y la actividad anti-fatiga, la promoción de la actividad de ADN, proteínas y la síntesis de lípidos en las células de médula ósea de los animales y así sucesivamente. Por otra parte, los ginsenósidos se han demostrado para mejorar la función cardiovascular y el nervio, facilitando la función colinérgica, el aumento de nivel de sinaptofisina en el hipocampo, y la protección de las neuronas de la corteza cerebral cultivadas contra la excitotoxicidad (Kim et al, 1998 (Lu et al., 2009);. Mook -Jung et al, 2001;.. Liao et al, 2002) .Brain anoxia los efectos beneficiosos de rb1 ginsenoside se mediada a través de barrido de los radicales libres (Lim et al, 1997), lo que mejora el metabolismo energético, y abstractpreserving la integridad estructural de. las neuronas (Jiang y Qian, 1995). Como miembro de ginsenósidos, ginsenoside R0 no se ha estudiado tanto como otros ginsenósidos (Zhang et al., 2001), se informó acerca de su actividad anti-inflamatoria (Matsuda et al., 1990), la actividad anti-hepatitic (Matsuda et al., 1991) y la mejora de la proliferación celular (Yu et al., 2005). Sin embargo, si tiene un efecto sobre la protección de las células de los radicales libres no está claro. Por lo tanto, en este estudio, se investigó el efecto protector de ginsenósidos R0 bajo un ambiente anóxico o oxidativo en vitro.Brain anoxia

Materiales y métodos Cultivo celular y agrupación

Una línea celular de feocromocitoma rattus norvegicus, PC12 (número PC12, ATCC ®: CRL-1721.1 TM) las células se cultivaron en 1640 (Hyclone, EE.UU.) suplementado con antibióticos y 10% de suero de ternera fetal (Hyclone, CA, EE.UU.) en una atmósfera humidificada atmósfera de 95% de aire y 5% de CO2 a 37 °.

Para comparar el efecto preventivo y efecto terapéutico de ginsenoside R0 con la inyección clásica libre radical scavenger edaravona (3-metil-1-fenil-2-pirazolin-5-ona) como control, las células se dividieron en 3 grupos principales: A. grupo de prevención, en la que las células se pretrataron con ginsenoside R0 o edaravona; B. grupo de terapia, en el que las células tratadas con ginsenoside R0 o edaravona después del daño anóxico o oxidativo; C.Brain grupo de control anoxia, en el cual las células fueron sólo con tratamientos de daño o sólo se tratan con el ginsenoside R0 o edaravona. tratamientos de prevención

Cuando las células de grupo de prevención estaban en 85% de confluencia de cada pocillo en placas de 6 pocillos, 20 l de ginsenósidos R0 (disuelto en 1640 medio; farmacéuticos nanjingzelang empresa, China) con una concentración de 2,5 mg / ml, 7,5 mg / ml y 12,5 mg / ml, y 20 edaravona l (huinanchanglong empresa farmacéutica bioquímicos, china) con una concentración de 1,0 mg / ml, 1,25 mg / ml y 1,5 mg / ml, se añadieron en el medio de cada pocillo, respectivamente, para el cultivo de 1 día. Ellos fueron marcados como prevención-R0-baja, la prevención-R0-mediados, la prevención-R0-alta, y la prevención-E, respectivamente. tratamientos daños

anoxia cerebral

Anóxico o daño oxidativo se realizaron a las células del grupo de terapia y el grupo de prevención pretratada mediante la adición de ditionito de sodio (30 mm) y peróxido de hidrógeno (0,3 mmol / L), respectivamente. tratamiento ditionito de sodio duró durante 2 h, mientras que el tratamiento de peróxido de hidrógeno se prolongó durante 30 min. Ellos fueron marcados como daño-S y el daño-H respectivamente. tratamientos de terapia

Después de los tratamientos de daños, se renovaron medios que contienen ditionito de sodio o peróxido de hidrógeno, 20 l de ginsenósidos R0 (2,5 mg / ml, 7,5 mg / ml y 12,5 mg / ml) o 20 edaravona l (1,0 mg / ml, 1,25 mg / ml y 1,5 se añadieron mg / ml) en el nuevo medio para la terapia. Ellos fueron marcados como terapia-R0-baja, la terapia-R0-edad, la terapia-R0-altos, tratamientos de control de anoxia andtherapy-E respectively.Brain

Células sólo tratadas con ginsenoside R0 o edaravona se han marcado como control negativo negativo-R0 y negativo-E, respectivamente; y los solamente tratan con ditionito de sodio o peróxido de hidrógeno se han marcado como control positivo positivo-S y positivo-H respectivamente. ensayo de azul alamar

La supervivencia de las células se determinó mediante el uso de ensayo de alamarBlue (Back et al, 1999;.. Lu et al, 2009; Yang y balcarcel, 2004). se añadieron 20 l de reactivo alamarBlue (Biosource, Nivelles, Bélgica) a 180 l de medio de cada pocillo en placa de 96 pocillos, y después se mantuvo la célula a 37 ℃ durante 4 h. Se monitorizó la absorbancia a 570 nm y longitud de onda de referencia a 600 nm en un lector de microplacas. Citometría de flujo

Después de diferentes tratamientos, las células PC12 se desprendieron y se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 min para recoger ellos, después se resuspendieron en PBS y counted.Brain citometría de flujo anoxia se realizó para determinar el porcentaje de apoptosis de las células PC12 en los diferentes grupos (Morimoto et al., 2000) con anexina V-FITC apoptosis determinar kit (Instituto beyotime de la biotecnología, China) acorgcording a las instrucciones del fabricante, utilizando Beckman laboratorio de células cuantos SC citometría de flujo (Beckman, EE.UU.) y su software correspondiente. Brevemente, las células se separaron y se lavaron con PBS dos veces. se añadió 195 solución de la combinación de la anexina V-FITC l a resuspendieron las células, después se añadió 5 l de anexina V-FITC y se mezcló suavemente. Las células se incubaron a 20-25 ℃ durante 10 minutos (evitando la luz), después se centrifugó a 1000 xg durante 5 min. Estas células se resuspendieron en 195 l de anexina V-FITC solución de combinación. 5-10 × 10 4 células y anoxia counted.Brain utilizando esto, se calculó el porcentaje de la acumulación de células apoptóticas en D2. MDA y el ensayo de SOD

Se recogió el medio de cultivo, a continuación, se lavaron las células con D-Hanks, raspado de las placas en 1 ml de PBS enfriado con hielo (0,1 M, que contiene 0,05 mm de EDTA), y se homogeneizó. El homogeneizado se centrifugó a 4.000 × g durante 30 min a 4 ℃. El sobrenadante resultante y medio recogido se utilizaron para el análisis. La MDA y SOD se midieron utilizando sus kits ELISA comerciales (Instituto Jiancheng bioingeniería, Nanjing, China) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, como para MDA, 100 l del sobrenadante / medio se mezcló con 1,5 ml de ácido acético (20%, v / v, pH 3,5), 1,5 ml de ácido tiobarbitúrico (0,8%, w / v), y 200 l de dodecil sulfato de sodio (8%, w / v).anoxia cerebral cada mezcla de reacción se calentó durante 60 min a 95 ℃ y se enfrió a temperatura ambiente. 5 ml de n-butanol se añadió entonces. Después de la mezcla y centrifugación a 3000 xg durante 10 min, se recogió la capa orgánica y la absorbancia medida a 532 nm; como para SOD, se añadieron 20 l de sobrenadante / medio con 200 l de solución de trabajo de tetrazolio soluble en agua y 20 l de enzima solución de trabajo a una placa de 96 pocillos. Después de incubar la placa a 37 ℃ durante 20 min, la absorbancia a 550 nm se leyó usando un lector de microplacas. Determinación de ROS intracelulares

los niveles de ROS intracelulares se determinaron con especies reactivas de oxígeno kit de ensayo (Instituto beyotime de la biotecnología, Shanghai, China) de acuerdo con protocol.Brain anoxia del fabricante brevemente, las células con diferentes tratamientos se lavaron con PBS y se incubaron con DCFH-DA a 37 ℃ para 30 min. distribución de fluorescencia DCF de estas células se detectó mediante una fluorescencia FLx800 y el lector de luminiscencia (instrumentos de BioTek, Vermont, EE.UU.) a una longitud de onda de excitación de 488 nm y a una longitud de onda de emisión de 525 nm. análisis estadístico

Todos los experimentos se realizaron por triplicado y los resultados se muestran gráficamente como media ± SD. La significación estadística de las diferencias entre grupos se calculó mediante la prueba t de Student. Los valores de probabilidad (p) de menos de 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. El análisis estadístico se realizó con el software SPSS (versión 11.0, SPSS inc.).anoxia cerebral

RESULTADOS La viabilidad de las células

La viabilidad de cada grupo de las células PC12 se detectó mediante el ensayo de alamarBlue, y se presentó como la proporción de supervivencia. Esta tasa de supervivencia fue significativamente baja en las células que sólo fueron tratados con ditionito de sodio (grupo-S positivo) o peróxido de hidrógeno (grupo-H positivo), en comparación con las células que sólo tratados con ginsenoside R0 (negativo-R0) o edaravona (negativo -E) (p0.05). La relación de supervivencia de las células que habían sido tratadas con edaravona antes de que el daño anóxico (grupo de prevención-E-daño-S) fue similar con que fig. 1. relación de supervivencia de las células PC12 en los diferentes grupos. Con ginsenoside R0 (2,5 mg / ml, 7,5 mg / ml, y 12,5 mg / ml) o edaravona (1,0 mg / ml, 1,25 mg / ml, y 1,5 mg / ml) de tratamiento, la relación de supervivencia de las células PC12 era estimated.Brain panel de anoxia (a) muestra la comparación en la prevención-R0-daño-S, daño-S-terapia-R0, positivos-S, y grupos-R0 negativos. Panel (B) muestra la comparación en la prevención-E-daño-S, daño-S-terapia-E, positivos-S, y los grupos negativos-E. El panel (C) compara la relación de supervivencia en la prevención-R0-daño-H, daño-H-terapia-R0, positivo-H, y grupos negativo-R0. Panel (D) compara la relación de supervivencia en la prevención-E-daño-H, daño-H-terapia-E, positivo-H, y grupos negativo-E. Los datos se expresan como media ± SD. En comparación con el control, * p0.05), mientras que la relación de supervivencia de las células tratadas con edaravona después del daño anóxico (daño-S-terapia-E grupo) fue significativamente mayor que en el grupo-S positivo (pp0.05, fig. 3A y 3B) .Brain anoxia en las células PC12, la expresión MDA fue significativamente mayor en el grupo-S positivo (p0.05), mientras que MDA en daños-S-terapia-R0, prevención-e-daño-S, y daños a grupos S-terapia-E fueron superiores a los controles negativos (pp0.05, fig. 3C). MDA celular en la prevención-R0-daño-H, daño-H-terapia-R0, la prevención-E-daño-H, y grupos daño-H-terapia-E fueron superiores a los controles negativos (pp0.05, fig. 4 ). Con el tratamiento ditionito de sodio, la actividad SOD celular en prevención-R0-daño-S, fig. 5. nivel intracelular de ROS en células PC12 con diferentes tratamientos. Con ginsenoside R0 (7,5 mg / ml) o edaravona (1,5 mg / ml) de tratamiento, intracelular de ROS se detectó en las células PC12 después de ditionito de sodio o daño peróxido de hidrógeno.anoxia cerebral los datos se expresan como media ± SD. En comparación con el control, * p0.05) (fig 4A).; la actividad celular SOD en la prevención-E-daño-S, daño-S-terapia-E, y negativo-E fue significativamente mayor que el grupo-S positivo (p0.05), y SOD en daños-S-terapia-E fue más bajo que los otros dos grupos (p0.05) (fig. 4B). Con el tratamiento de peróxido de hidrógeno, la actividad SOD celular en la prevención-R0-daño-S, daño-S-terapia-R0, y negativo-R0 fue significativamente mayor que los S-positivos (P0,05), y la prevención-R0-Daños a S fue mayor que el daño-H-terapia-R0 (p0.05) (fig. 4C). actividad SOD celular en la prevención-E-daño-H y negativo-E fue mayor que el positivo-H (p0.05), pero la SOD en daños-H-terapia-E fue menor que el positivo-H (p0.05 ) (fig. 4D).anoxia cerebral nivel intracelular de ROS

El ditionito sódico y tratamientos de peróxido de hidrógeno aumentó significativamente el nivel intracelular de ROS, especialmente el peróxido de hidrógeno. El pretratamiento con ginsenoside R0 inhibió significativamente el nivel intracelular elevado de ROS por ditionito de sodio o peróxido de hidrógeno (p0.05), mientras que el pretratamiento con edaravona tuvo menos efecto en el proceso contra los daños de peróxido de hidrógeno que en el daño ditionito de sodio (p0.05). Tratados con cualquiera de ginsenósidos R0 o edaravona después de que ambos daños disminuyeron significativamente el nivel intracelular de ROS (p0.05; Fig. 5).

DISCUSIÓN

La mayoría de los estudios previos para ginsenósidos se llevaron a cabo in vitro y se centró en neurons.Brain anoxia Leung et al. Estudiaron los efectos neuroprotectores de Ginsenosido RG1 en las neuronas de la sustancia negra primarios contra toxicidad rotenona (Leung et al., 2007). Teniendo en cuenta que ginsenósidos no pudieron llegar a una concentración suficiente en las neuronas in vivo, se eligieron las células PC12 para el estudio in vitro para investigar los efectos de ginsenoside R0 bajo un ambiente anóxico o oxidativo. Esta línea celular se estableció a partir de una rata trasplantable feocromocitoma adrenal de rata, que responden de forma reversible a NGF (factor de crecimiento nervioso) por inducción del fenotipo neuronal, y es un útil sistemas modelo para estudios neurobiológicos y neuroquímicos.

En nuestro estudio, hemos utilizado primero 3 concentraciones diferentes de ginsenoside R0 y edaravona para pretratar o tratar células PC12 después de un daño anóxico o oxidativo, y encontramos la relación de supervivencia aumentó cuando la concentración de ginsenósidos R0 aumentó de 2,5 mg / ml a 7,5 mg / ml (p0.05), pero la tasa de supervivencia no aumentó mucho cuando la concentración aumentó de 7,5 mg / ml a 12,5 mg / ml; la relación de supervivencia no era tanto efectúa por los cambios de la concentración edaravona.anoxia cerebral decidimos que las concentraciones óptimas para usar en este experimento son 7,5 mg / ml de ginsenoside R0 y 1,5 mg / ml de edaravona. En este estudio, se encontró que tanto el pretratamiento y el tratamiento con ginsenoside R0 aumentarían la relación de supervivencia de las células PC12 cuando se sometió a un daño anóxico por ditionito de sodio o un daño oxidativo por el peróxido de hidrógeno; el tratamiento con edaravona también aumentaría la tasa de supervivencia en los dos daños respectivamente, sin embargo, el pretratamiento con edaravona no conseguir una buena relación tal supervivencia, especialmente en el daño anóxico, que era similar con el grupo-S positiva (fig. 1 ). Los resultados de las células apoptóticas obtenidas de citometría de flujo apoyaron la tasa de supervivencia (Fig. 2).anoxia cerebral parece que el ginsenoside R0 tenido buenos efectos preventivos y terapéuticos en un daño anóxico o oxidativo a las células PC12, mientras edavarona tenía efectos terapéuticos sobre los daños ambos, pero sólo tenía efectos preventivos sobre los daños oxidativos, y los efectos terapéuticos de edavarona no era tan bueno como ginsenósidos R0. Nuestro estudio mostró un efecto protector y terapéutico más pobre de edavarona de ginsenósidos R0.

Por lo tanto, hemos asumido que ginsenoside R0 podría tener una capacidad para proteger las células contra los daños oxidativos y anóxicas, al igual que algunos otros miembros de ginsenósidos, y su efecto protector podría debido a la función antioxidante. Para verificar esta hipótesis, el nivel de expresión de MDA y la actividad SOD se detectaron en las células PC12 y su medio de cultivo que eran con diferentes tratamientos de ginsenoside R0 y edaravone.Brain anoxia MDA es un producto principal de daño oxidativo y SOD es un importante enzimas antioxidantes. Se ha demostrado que la SOD tiene la capacidad de transformar aniones superóxido a peróxido de hidrógeno. Nivel elevado GSH, la actividad SOD proporcionar un mecanismo de reparación para componentes de membrana oxidados (Xiao et al., 2008).

Este estudio encontró que el tratamiento de células PC12 con ditionito de sodio causó un marcado aumento en el estrés oxidativo según se caracteriza por la producción excesiva MDA y una reducción en la actividad de SOD. los niveles de MDA y actividades de SOD variado mucho en las células con diferentes tratamientos, pero no tanto en el medio de cultivo. Para cualquiera de los tratamientos daño anóxico o oxidativo en las células PC12, tanto ginsenoside R0 y edaravona tenían un mejor efecto en la disminución de nivel de MDA con el pretratamiento, y los efectos preventivos de ginsenoside R0 fueron mejores que edaravone.Brain anoxia por daños anóxica en células PC12, ginsenoside R0 tenido un mejor efecto sobre el mantenimiento de una actividad de SOD mayor que edavarona, no importa con tratamientos previos o tratamientos, y edavarona pretratados tenían un mejor efecto que tratarse después del daño. Para el daño oxidativo en las células PC12, edaravona no tuvo ningún efecto cuando se tratan antes de daños, e incluso disminuir la actividad SOD cuando son tratados después de un daño; mientras ginsenoside R0 todavía tenía un efecto sobre el mantenimiento de una buena actividad de SOD. Se sugirió que el efecto protector de células de ginsenósidos R0 puede estar relacionado con la acción antioxidante.