Los efectos protectores de los suplementos de ácidos grasos polyunsatutared contra el daño testicular inducida por hipoxia hipobárica intermitente en ratas hipoxia anoxia

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Intermitente hipoxia hipobárica (IHH) induce cambios en el estado redox y la estructura en testículos de ratas. Estos efectos pueden estar presentes en las personas a gran altura, como los atletas y los mineros. Los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) pueden ser eficaces en contrarrestar estas modificaciones oxidativas debido a sus propiedades antioxidantes. El objetivo del trabajo fue evaluar si la suplementación con PUFA atenúa el daño oxidativo en los testículos, reforzando el sistema de defensa antioxidante. Los animales se dividieron en cuatro grupos (7 ratas por grupo): normoxia normobárica (~ 750 tor; po2 156 mmHg; nx); nx + PUFA, suplementado con PUFA (DHA: EPA = 3: 1; 0,3 g kg-1 de peso corporal por día); hipoxia hipóxica (~ 428 tor; po2 90 mmHg; hx) y, hx + anoxia PUFA.Hypoxia


los grupos hipóxicas fueron expuestos en 4 ciclos de 96 h de HH seguido de 96 h de normoxia normobárica durante 32 días. La capacidad total de antioxidante (FRAP) y la peroxidación de lípidos (malondialdehído, MDA) en plasma y la relación de glutatión reducido (GSH) / oxidado (GSSG), la peroxidación de lípidos de tejidos (TBARS) y la actividad de las enzimas antioxidantes se evaluaron al final del estudio en los testículos. Además, se determinaron SIRT1 y HIF-1 la expresión de proteínas en los testículos.

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Los seres humanos a altas altitudes están expuestos a la hipoxia hipobárica, una condición donde reduce la presión barométrica disminuye la disponibilidad de oxígeno [1] resultante en los niveles de oxígeno que circulan inferiores [2]. Las poblaciones que viven en altitudes elevadas están expuestos a hipoxia hipobárica crónica mientras que las actividades tales como deportes de montaña, turismo y ciertos empleos-(es decir,anoxia hipoxia los agentes de aduanas, la minería, trabajadores de la educación y salud) realizadas en las zonas más de 1.500 metros sobre el nivel del mar (msnm) implican la exposición intermitente a la hipoxia hipobárica (IHH) [3- 5].

A grandes altitudes, el estrés oxidativo es más alto que al nivel del mar en condiciones normobáricas, debido a una combinación de factores como la fluctuación de la temperatura, aumento de la intensidad de la luz UV y la tasa metabólica, baja oxigenación de la sangre y anoxia localizada / reoxigenación [6]. Debido a su naturaleza ubicua, el aumento de las especies de oxígeno reactivas (ROS) pueden causar daño de la membrana celular a través de la peroxidación lipídica, la oxidación de proteínas, daño en el ADN, y consecutivamente deterioro de la producción de ATP [7, 8]. El estrés oxidativo también puede producir hinchazón celular, disminuir fluidez de la membrana celular, impide el mantenimiento de gradientes iónicos y conducir a la inflamación de los tejidos, lo que puede dar lugar a efectos perjudiciales estructurales y funcionales [6] .Hypoxia anoxia crónica y IHH han sido asociados con un aumento de daño oxidativo en el testículo [9]. IHH induce mayores niveles de peroxidación de lípidos, reduce la actividad de la glutatión reductasa, y disminuye el recuento de espermatozoides del epidídimo [10]. Estos cambios han sido parcialmente atenuada por la suplementación de antioxidantes tales como la melatonina y ascorbato [10, 11].

Estudios y ensayos de intervención clínicos han demostrado un papel protector probable de los aceites de pescado en la dieta y n-3 ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) en las enfermedades cardiovasculares [12- 14]. Los efectos beneficiosos se han atribuido a la mejora de la función de la célula endotelial vascular, la mejora de la reactividad vascular y el cumplimiento, la modulación del metabolismo de lípidos y la reducción de la producción de citoquinas inflamatorias [15] .Hypoxia anoxia ácido docosahexaenoico (DHA, C22: 6 n-3), un importante n-3 PUFA, se reconoce generalmente como un componente fisiológicamente activo de estos efectos [16]. Los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a los efectos beneficiosos de DHA en diversos tipos de células durante la isquemia-reperfusión (IR), especialmente los cardiomiocitos, endotelio vascular, y las células del músculo liso, se han estudiado ampliamente [17, 18]. Estos mecanismos protectores incluyen las vías de inducción anti-inflamatorios de la transcripción, la disminución de la ca intracelular 2 + niveles, la supresión de la proliferación vascular, y la mejora de la integridad de la membrana celular [19, 20]. De hecho, PUFA puede inducir un mecanismo antioxidante a través de la inducción de la relacionada con el factor de 2 eritroide nuclear factor de 2 (nrf2), un factor transcripcional maestro para genes antioxidantes y la síntesis de glutatión en el tejido vascular [21].anoxia hipoxia en los testículos, PUFA puede ser beneficioso para mejorar la motilidad del esperma y la viabilidad después de la lesión inducida por la doxorrubicina aguda [22]. Sin embargo, los efectos de PUFA sobre los marcadores de estrés oxidativo y los mecanismos antioxidantes no han sido bien caracterizado en el testículo.

Por lo tanto, en un modelo de rata establecida de IHH la hipótesis de que la suplementación con PUFA atenúa el daño oxidativo en el testículo mediante el refuerzo del sistema de defensa antioxidante.

Diseño experimental

Todo el cuidado de los animales y los procedimientos cumplido con los principios del cuidado de los animales descritos por el laboratorio de la sociedad nacional y la investigación médica, y la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (Instituto de los recursos con animales de laboratorio, 1996), y fueron aprobados por la facultad del comité de bioética de la medicina. (Número de estudio: CBA # 0627 FMUCH).anoxia hipoxia todos los experimentos se llevaron a cabo en ratas Wistar macho adultas (n = 28). Los animales se dividieron al azar en cuatro grupos iguales: normoxia normobárica (~ 750 tor; po2 156 mmHg; nx, n = 7); nx + PUFA (n = 7), suplementado con PUFA (DHA: EPA = 3: 1; 0,3 GKG 1d -1) a través de sonda nasogástrica; hipoxia hipóxica (~ 428 tor; po2 90 mmHg; hx, n = 7) y, hx + PUFA (n = 7). Los grupos hipóxicas fueron expuestos en 4 ciclos de 96 h de hipoxia hipobárica seguido de 96 h de normoxia normobárica durante 32 días. La presión deseada dentro de la cámara hipobárica se logró mediante los cambios de presión que simulan altitud incrementos de 150 m por minuto. Los animales en los grupos NX se alojaron en la misma habitación que el HX (22 ° C). Los 4 grupos recibieron la misma cantidad de comida diaria y el agua potable (15 g de comidas estándar de pellets; agua ad libitum) peso corporal .Hypoxia anoxia se determinó al comienzo del estudio y después cada dos días, y al final de cada período. La suplementación con PUFA se mantuvo durante los 32 días del estudio. Al final del estudio y después de las muestras de sangre y la extracción de tejido, las ratas se sacrificaron por dislocación cervical en una habitación separada de los animales restantes.

Evaluación del estado redox en los testículos

Los testículos se homogeneizaron en 0,5 ml de tampón de extracción (Tris 50 mM, NaCl 100 mm, EDTA 1 mm, EGTA 2,5 mm, Tween-20 0,1% [pH 7,4], fluoruro de fenilmetilsulfonilo [PMSF] 100 mg / ml; Sigma-Aldrich ) con un homogeneizador Potter (vidrio-col K4424; col glas, Terre Haute, Indiana) a 0,050301 x g. Las muestras se centrifugaron después a 7820 × g durante 30 minutos a 4 ° C.anoxia hipoxia

El ensayo de SOD de Cu-Zn se basa en el aumento de SOD-mediada de la tasa de autooxidación de los catecoles en una solución alcalina acuosa a fin de producir un cromóforo con una absorbancia máxima de 525 nm [25]. Una unidad de SOD de Cu-Zn se define como la actividad que duplica el fondo de auto-oxidación, y los resultados se expresan como unidades / mg de proteína. actividad GSH-px Soluble se midió espectrofotométricamente en la fracción citosólica (100.000 g sobrenadante) por la reducción de disulfuro de glutatión acoplado a la oxidación de NADPH por el glutatión reductasa [26]. Una unidad GSH-px se define como la actividad que oxida 1 mol de NADPH / min y se expresa como unidades / mg de proteína.

El estado redox en el tejido testicular se evaluó mediante un método fluorométrico con el fin de medir oxidado (GSSG) y glutatión reducido (GSH) .Hypoxia anoxia el o-ftalaldehído (OPT) se utilizó como un reactivo fluorescente. Este método evalúa la reacción de GSH con OPT a pH 8 y de GSSG con OPT a pH 12; GSH puede complejarse a N-etilmaleimida para evitar la interferencia de GSH con la medición de GSSG [27]. A continuación, se calculó la relación GSH/GSSG. La peroxidación de lípidos se evaluó mediante la reacción de ácido tiobarbitúrico a pH 3,5, seguido por extracción con disolvente con una mezcla de n-butanol / piridina (15: 1, v / v) [28]. Tetrametoxipropano se usó como el estándar externo, y no se detectó espectrofotométricamente los niveles de peróxidos de lípidos a 532 nm y se expresó como TBARS mmol (sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico) / mg de proteína.

SIRT1 y HIF-1α expresión determinado por transferencia de western (SDS / PAGE)

anoxia hipoxia

Las alícuotas de homogenato de tejido testicular de testículo que contiene una concentración igual de proteínas, 50 g, se sometieron a electroforesis (100 V) en un gel de SDS / PAGE al 12% como se ha descrito previamente por farias et al. [10], utilizando un anticuerpo SIRT1 ratón primaria contra rata (# 8469; 1: 250 dilución) (la señalización celular, inc, MA, EE.UU.)., Un conejo primaria HIF-1α (sc-10790; dilución 1: 250) (biotecnología Santa Cruz, Santa Cruz, CA, EE.UU.), un anti-ratón secundario (# 7076; 1: 1000) y un anticuerpo secundario anti-conejo (IC-3R01; 1 (la señalización celular, inc, MA, EE.UU.). : 1000) (imuny Rheabiotech, SP, Brasil). Finalmente, un anticuerpo de ratón primario β-tubulina (# 3873; 1: 500) (. Señalización celular, inc, MA, EE.UU.) se utilizó como control de carga en todo western blot assays.Hypoxia anoxia las bandas obtenidas se analizaron con el software ImageJ (http://imagej.Nih.Gov/ij/) y los valores de densidad integradas de las bandas de la glutatión reductasa se normalizaron dividiendo por el valor de la banda de control de carga.

Discusión

Nuestros resultados demuestran que el modelo IHH indujo un estado prooxidante en el plasma y los testículos de ratas. El daño oxidativo se atenuó por la suplementación crónica con ácidos grasos omega-3. El mecanismo molecular del efecto protector de PUFA puede implicar la inducción de efectos antioxidantes.

Las determinaciones de la evolución temporal de marcadores de estrés oxidativo son importantes para el estudio de los modelos clínicos asociados con IHH, como la hipertensión pulmonar y la apnea obstructiva del sueño [29].anoxia hipoxia aumentos en parámetros de estrés oxidativo se han demostrado en un modelo de menor exposición humana hipoxia, tales como productos de peroxidación de lípidos in vivo (es decir, F2-isoprostanos) y sistémica estrés oxidativo [30, 31]. De hecho, la capacidad antioxidante, evaluado a través de la reducción de la capacidad de plasma (FRAP) niveles ha sido menor en la exposición hipóxica aguda en comparación con las condiciones normobáricas en los deportes [32, 33]. Además, este estado prooxidante inducida por IHH se ha relacionado con la aparición de estrés oxidativo en los tejidos locales en ratas, tales como cerebro, corazón, pulmón y riñón [4, 34]. En nuestro estudio, crónica IHH causó niveles FRAP inferiores (Figura 1A) y los niveles de MDA superiores (Figura 1B) en el plasma, estos cambios redox son consistentes con los efectos sistémicos prooxidantes inducidos por nuestro modelo de IHH.Hypoxia anoxia sin embargo, los efectos de desequilibrio prooxidante asociado con IHH en testículos están pobremente caracterizados.

ratas Wistar macho han respondido a la hipoxia crónica con cambios de sangre y tejidos, se asemeja a la respuesta humana a altas altitudes, incluyendo poliglobulia e hipertrofia ventricular derecha [35]. IHH conduce a una disminución en la masa testicular, un aumento en el espacio intersticial, y una reducción del epitelio seminal [9, 36]. Trabajos recientes han reforzado la existencia de un metabolismo oxidativo en el epidídimo de ratas sometidas a hipoxia hipobárica debido al aumento en la expresión de la enzima regulador de ROS. Este aumento de la producción de ROS induce una alta tasa de apoptosis a nivel de la célula germinal, lo que lleva a un estado de hipo-espermatogénesis que puede poner en peligro la fertilidad masculina [36] .Hypoxia anoxia en nuestro estudio, la vulnerabilidad del tejido reproductor masculino a los desafíos oxidativos provocados por IHH puede depender de la actividad del sistema antioxidante, por ejemplo Las vías de glutatión (actividad glutatión reductasa) [10]. Con respecto a estos resultados, nuestros resultados son consistentes con el estado prooxidante tejido, se demuestra por los niveles más bajos de SOD, GSH-px y la relación GSH / GSSG y los niveles más altos de TBARS determinada en testículos de ratas sometidas a IHH en comparación con el grupo nx (figuras 2 y y3 3).

Las respuestas transcripcionales inducidos por hipoxia están altamente regulados en el desarrollo normal y están desreguladas en muchas enfermedades [37]. HIF-1 está formada por dos subunidades: HIF-1α y HIF-1β se han identificado como proteínas que contienen una hélice de hebilla-hélice básico y un PER / ARNT / sim dominio (PAS), que son responsables de la inducción hipóxica de la eritropoyetina .Hypoxia anoxia bajo niveles de oxígeno reducidos, estas dos proteínas heterodimerizan en el núcleo e inducen la transcripción de genes implicados en la angiogénesis, metabólicas y adaptación hipóxica y la resistencia al estrés oxidativo y aumentan las propiedades invasivas [38]. En la isquemia inducida por la hipoxia hipobárica, HIF-1α activa transcripcionalmente cientos de genes vitales para la homeostasis celular y la angiogénesis. Aunque potencialmente beneficioso en la isquemia, la regulación al alza del factor de transcripción HIF-1α se ha relacionado con la inflamación y el estrés oxidativo ocurrencia [39]. De acuerdo con esto, nuestros resultados demostraron niveles más elevados de HIF-1α en testículos de ratas sometidas a IHH en comparación con el grupo nx (figura 4).anoxia hipoxia

Informes recientes han demostrado que PUFA son beneficiosos contra cerebro estructural y la lesión por IR cardíaca [40, 41]. Aunque los mecanismos protectores asociados con la administración de suplementos de PUFA no se entienden completamente, algunos han sugerido que la protección PUFA es principalmente a través de efectos anti-inflamatorios, tales como la inhibición de la infiltración de monocitos, la activación de NF-kappaB y el aumento de la biosíntesis de compuestos activos anti-inflamatorios (resolvins- derivan del metabolismo de PUFA) [42]. Por otro lado, la inducción de mecanismos de defensa antioxidantes está relacionada con efectos directos ejercidas sobre la membrana celular y la inducción de respuestas genómicas. Esta actividad antioxidante puede actuar como un mecanismo homeostático contrarrestar el aumento del estrés oxidativo inducido por IHH, tales como la inducción de las actividades antioxidantes y desintoxicantes [43] .Hypoxia anoxia nuestros resultados mostraron que la administración PUFA podría contrarrestar eficazmente daños prooxidante, mediada por la atenuación de estrés sistémico y oxidativa del tejido inducida por IHH. Esto se refleja por un aumento de SOD y las actividades de GSH-px (Figura 2A-B), una reducción de la peroxidación lipídica y aumento de los valores FRAP (Figura 1A). Estos efectos obtenidos a través de las dosis farmacológicas (suplementación), confirman el papel útil de PUFA como un antioxidante prometedor contra IHH; sin embargo, el tipo de efecto antioxidante, por ejemplo scavenger o inducción compuesto antioxidante probable, no ha sido claramente descrita.

En el estudio actual, procuramos explorar algunas vías moleculares relacionados con la inducción de proteínas de la familia anoxia sirtuin responses.Hypoxia antioxidante están involucradas en aspectos específicos del metabolismo y ROS barrido de proteínas, y sirtuin-1 y sirtuin-3 en particular, han sido efectos exhibidos sobre la actividad de las enzimas antioxidantes [44]. Algunos trabajos muestran que la regulación al alza de SIRT1 suprime los niveles de expresión de citoquinas pro-inflamatorias y aumenta los niveles de expresión de SOD y catalasa en astrocitos, el músculo esquelético y los cardiomiocitos, induciendo de este modo la protección celular [45, 46]. La evidencia experimental sugiere que PUFA ejercer funciones anti-inflamatorios en ambos modelos humanos y animales mediante el aumento de la expresión, la fosforilación y la actividad de la vía de AMPK, que además conduce a SIRT1 sobreexpresión [47, 48] sin embargo .Hypoxia anoxia, los efectos antioxidantes no son bien caracterizado. En nuestro estudio, no se encontraron diferencias significativas después de la administración de AGPI en el grupo nx, y puede ser que la dosis utilizada (0,3 GKG 1d -1) fue menor que la dosis a la que ejercen efectos antioxidantes en otros órganos, como el corazón , cerebro y de intestino de rata tejidos [48, 49]. Por otra parte, la incorporación de estos ácidos grasos en las membranas biológicas no se midió en este estudio, un factor significativo en la determinación del efecto protector contra el estrés oxidativo, por ejemplo DHA [50, 51]. Sin embargo, el papel de otras rutas de transcripción no se puede descartar, por ejemplo de las vías de señalización dependientes de Nrf2. De hecho, nuestros datos mostraron niveles más bajos de los niveles de proteína sirtuin-1 en IHH testículo de rata, efectos revertida por la suplementación con PUFA.anoxia hipoxia esto explicaría un mecanismo probable inducida por lesión hipóxica de corto plazo no asociado con el efecto del preacondicionamiento [52] (Figura 4).