us20010031730 de Patentes – método para el tratamiento de trastornos relacionados con glutamato – Google patentes hipoxia y anoxia

La deficiencia de tiamina durante mucho tiempo ha sido conocido por causar trastornos neurológicos, tales como el síndrome de Wernicke-koraskoff o el beriberi cerebral. Muchos de los síntomas del síndrome de Wernicke-Korsakoff paralelos a los de la enfermedad de Alzheimer, en particular con respecto a la pérdida de memoria, confusión mental y la demencia. El gen para la enfermedad de aparición temprana familial Alzheimer se ha identificado recientemente a ser coincidente con la posición (14q24.3) del gen que codifica el componente e2k humana (dihidrolipoil succinil transferasa) del complejo α-cetoglutarato deshidrogenasa (KDH), una tiamina (. ali et al., 1994; Nakano et al, 1994) el sistema de enzimas pirofosfato-dependiente.


Esta posición cromosómica también está asociado con otro trastorno neurológico heredado, de Machado-Joseph disease.Hypoxia y anoxia el daño neurológico asociado con la deficiencia de tiamina se cree que es debido a un aumento en los niveles de glutamato extracelular durante períodos de depresión KDH (Hazell et al., 1993; Butterworth Heroux, 1995). Además, se cree que la toxicidad del glutamato estar involucrado en muchas enfermedades neurodegenerativas, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, parkinsonismo, derrame cerebral y la epilepsia, así como la hipertensión, la hipoglucemia y trastornos mentales tales como la esquizofrenia.

Un esfuerzo considerable se ha dedicado al descubrimiento de antagonistas de glutamato (B. Scatton, ciencias de la vida, 55, 2115-2124 (1994);… SA Lipton et al, N. Engl J. Med, 330, 613-622 (1994) ) en los últimos años, debido a la creciente evidencia que vincula la excitotoxicidad del glutamato a diversos trastornos neurológicos (R.Hypoxia y anoxia J. Thomas, J. Am. Geriatr. Soc., 43, 1279-1289 (1995)). Desafortunadamente, mientras que los antagonistas conocidos pueden proporcionar neuroprotección, la acción excesiva de estos agentes bloqueantes clásicos puede obtener efectos secundarios indeseables (Scatton, supra; Lipton et al (1994), supra.). Para minimizar estos efectos secundarios indeseables, la modificación de los grupos sulfhidrilo modulador redox del receptor de glutamato se ha sugerido como una estrategia terapéutica posiblemente superior (H. Gozlan et al., Extremidades, 16, 368-374 (1995)). A diferencia de los antagonistas clásicos que pueden dar la inhibición completa por la interacción en el receptor de glutamato (por ejemplo, CGS 19755) o directamente en, canales de iones de calcio del receptor ligado (por ejemplo, fenciclidina o MK-801) (Lipton et al. (1994), supra) se espera que la inhibición a través de los sitios redox moduladores para dar la inhibición solamente parcial de la función y de ese modo limitar los efectos secundarios no deseados asociados con el antagonismo excesivo (Gozlan, supra).Hipoxia y anoxia En la actualidad S-nitrosilación de receptores de glutamato por un donante de NO + (por ejemplo, nitroglicerina) es el único mecanismo para parcialmente el bloqueo de la respuesta del receptor in vivo, que permita lograr este efecto mediante la interacción con los sitios redox moduladores (SA Lipton et al., Nature (Londres), 364, 626-632 (1993);. SA Lipton, Neurochem, 29, 111-114 (1996)).

Tal como se utiliza aquí, el término “trastorno relacionado con glutamato-” comprende: a) enfermedades neurodegenerativas asociadas con niveles elevados de glutamato extracelular, incluyendo la enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, síndrome adquirido de inmunodeficiencia (SIDA), epilepsia, adicción a la nicotina, la isquemia cerebral (apoplejía), y la esclerosis lateral amiotrófica familiar (ELA); así como enfermedades neurodegenerativas asociadas con la deficiencia de tiamina, tales como el síndrome de Wernicke-Korsakoff, beriberi cerebral, enfermedad de Machado-Joseph, enfermedad Soshin, y las enfermedades relacionadas, tales como los dados a conocer por Thomas et al., J.Hipoxia y anoxia a.m. Geriatr. Soc, 43, 1279 (1995).; y b) otras enfermedades o condiciones en las que está implicada la actividad de glutamato, tales como ansiedad, convulsiones relacionadas con glutamato, encefalopatía hepática, dolor neuropático, el envenenamiento por ácido domoico, hipoxia, anoxia, trauma mecánico en el sistema nervioso, hipertensión, convulsiones por abstinencia de alcohol, adicción al alcohol , las ansias de alcohol, isquemia cardiovascular, convulsiones de oxígeno, y la hipoglucemia.

DETC-me se sintetizó empleando una modificación del método de P. Klason, J. Prak. Chemie, 36, 67 (1887). El sulfuro de carbonilo, producido mediante goteo de KSCN saturado en ácido sulfúrico 48%, se hizo burbujear en una mezcla de 11,3 ml de trietilamina y 7,7 ml de dietilamina en 100 ml de alcohol t-butilo en 250 ml de fondo redondo de flask.Hypoxia y anoxia, la solución se agitó como el gas burbujea a través de la solución de amina, con la reacción proceder durante 15 a 20 horas. La reacción se terminó mediante la adición de 5 ml de yoduro de metilo para formar el producto metilado final. La mezcla de reacción se volvió amarilla y de 15 a 20 minutos más tarde se formó un precipitado blanco. Después de 45 minutos, la mezcla de reacción se filtró y se evaporó el alcohol y otros materiales volátiles. La fase de aceite restante se disolvió en cloruro de metileno y se extrajo con HCl al 10%, NaHCO3 saturado y salmuera. La fase orgánica resultante se secó sobre sulfato de sodio, y se evaporó a vacío. El producto resultante se purificó por cromatografía líquida de media presión (C-18 sepralite® 40! M, fase móvil de 60:40 de acetonitrilo (Fisher Scientific, grado HPLC): agua) .Hypoxia y las fracciones que contienen el anoxia DETC-me se extrajeron con cloruro de metileno . La fase orgánica se secó con sulfato de sodio y el disolvente se eliminó a presión reducida. El producto (alrededor de 4 g) fue un aceite amarillo pálido. La estructura verificada por TLC, RMN [1H RMN (80 MHz, CDCl3), δ3.35 (q, J = 7 Hz, 2H), δ2.50 (s, 3H), δ1.15 (t, J = 8 Hz, 3H)], y la espectroscopia de masas [EIMS m / z (intensidad relativa) 147 (M +, 13), 100 (75), 75 (24), 72 (100), 44 (69)].

Ejemplo 2 •

DETC-me (600 mg) se añadió a una suspensión de 0,865 g de metaperyodato de sodio (Chem Aldrich Co..) En 8 ml de 1: 1 de metanol-agua a 25 ° C. Después de 48 horas de agitación a 25 ° C. , la mezcla de reacción se extrajo con CH 2Cl 2. la capa orgánica se secó con sulfato de sodio y el disolvente se eliminó bajo reducida pressure.Hypoxia y anoxia el producto bruto se disolvió en una cantidad mínima de 1: 1 de acetonitrilo-H 2O y se purificó por cromatografía de media presión (fase móvil C-18 sepralite® 40 micras. 1: 1 de acetonitrilo-H 2O fracciones que contenían DETC-me sulfóxido se agruparon y se extrajo con cloruro de metileno El disolvente se secó con sulfato de sodio y se eliminó bajo presión reducida para producir 0,46. g de DETC-me sulfóxido como un aceite amarillento; [1H RMN (500 MHz, CDCl3) 3,5696-3,4661 (m, 2H), 3,4428-3,3850 (m, 2H), 2,7082 (s, 3H), 1,2257 (t, 3H, J = 7,12 Hz), 1,1698 (t, 3H, J = 7,09 Hz); espectroscopia de masas: CIMS (NH 3) M / Z (intensidad relativa), 164 (M + 1, 13), 148 (3), 100 (100), 72 (86), 44 (82 ); IR (neto): 2980, 1690, 1420, 1255, 1210, 1065, 1035 cm -1] .Hypoxia y anoxia

Ejemplo 3 •

S-metil-N, sulfóxido de N-dietilditiocarbamato (DDTC-meso) se preparó a partir de S-metil-N, N-dietilditiocarbamato (DDTC-me). La síntesis de DDTC-me se llevó a cabo como se describe por MD Faiman et al, alcoholismo, 7, 307 (1983), metaperyodato de sodio (200 mg) (Sigma chemical co.) Se disolvió en 25 ml de 50:50 de MeOH.: H 2O a 0 ° C. DDTC-me (200 mg) se disolvió separadamente en 2 ml de metanol, y luego se enfrió a 0 ° C. Antes de la adición a una solución constante de agitación de metaperyodato sódico en MeOH: H 2O. La mezcla de reacción se agitó durante 24 horas a 0 ° C y después se diluyó a 100 ml con tampón frío de fosfato de potasio 0,1 M (pH 7,4). Después, la solución incolora resultante se extrajo con cloruro de metileno.Hipoxia y anoxia la capa orgánica se trató con carbón vegetal activado, y el carbón se separó por filtración a través de un lecho de celite. El disolvente se eliminó a presión reducida para obtener el producto bruto que se purificó después por HPLC preparativa (C-18, 5 micras, 150 mm x 10 mm columna, Alltech), utilizando 30:70 de acetonitrilo: H 2O (acetonitrilo, Fisher Scientific, grado HPLC) a un caudal de 2,5 ml / min. Las fracciones que contienen el DDTC-meso se combinaron y se diluyeron con cuatro veces el volumen original con agua. Las fracciones reunidas diluidas se extrajeron con cloruro de metileno. El disolvente se secó con sulfato de sodio y se eliminó bajo presión reducida para producir 50 mg de producto de un aceite incoloro: RMN 1H (300 MHz, CDCl3) 3,25-3,42 (m, 4H), 2,72 (s, 3H), 1,23 (t , 3H), 1,17 (t, 3H); espectroscopia de masas: CIMS (NH 3) M / Z, 180 (M + 1); IR (neto): 2954, 1668, 1436, 1400, 1317, 1136, 1113, 747 cm-1.Hipoxia y anoxia

Ejemplo 4 •

A una dosis de 5,2 mg / kg i.p. En ratones, DETC-meso logra 80% de inactivación de ALDH en 1 hora. Dado que la tasa de inactivación de la enzima es 40 M -1 s -1 en condiciones fisiológicas, la concentración efectiva de DETC-meso en su sitio de acción in vivo es de aproximadamente 11 m. Si el DETC-meso fueron simplemente uniformemente dispersa por todo el animal, su concentración sería de aproximadamente 32! M. Esto implicaría una entrega y utilización muy eficaz de DETC-meso, sin embargo, no tiene en cuenta las más altas concentraciones de GSH que están presentes en la sangre, 1 mm, a menos de 5% de DETC-meso permanecería después de 5 minutos. En el hígado, menos de 3% de DETC-meso permanecería después de sólo un minuto. GSH en realidad media el efecto de DETC-meso.Hypoxia y anoxia carbamoiló GSH inactiva ALDH y / o bloques de glutamato unión a las membranas sinápticas casi tan eficazmente como DETC-meso (in vivo, pero no in vitro), cuando el primero se inyecta con vacío O por vía intraperitoneal En ratones. Sin embargo, para completar este ciclo de la carbamoilada GSH debe ser activado por oxidación. Esto puede lograrse a través de la glutatión peroxidasa a expensas de peróxido de hidrógeno intracelular.

se utilizaron animales macho ratones Swiss Webster (20-30 g) o ratas Sprague-Dawley macho (250-300 g). Todos los experimentos que emplearon los animales se llevaron a cabo en estricto cumplimiento de las directrices de NIH sobre el uso de animales y reglamentos institucionales referentes a la experimentación con animales. Los animales fueron expuestos a oxígeno hiperbárico en una cámara de presión especialmente diseñada como se describe anteriormente (M.Hypoxia y anoxia D. Faiman et al, Biochem Pharmacol, 20, 3.049-3.067 (1971);…. MD Faiman et al, aerosp. Med., 45, 29032 (1974)). El tiempo hasta la primera convulsión clónica-tónico después salmuera animales a una presión final de cinco atmósferas de oxígeno al 100% o después de la inyección intraperitoneal de convulsants se observó por criterios descritos anteriormente (MD Faiman et al (1971), supra;. MD Faiman et al . (1974), supra). A menos que se especifique lo contrario, la capacidad de DETC-meso para prevenir las convulsiones fue probado por inyección intraperitoneal de 5,2 mg / kg de DETC-meso 1-2 horas antes de llevar el animal a una presión final de 5 atmósferas de oxígeno al 100% o inyección intraperitoneal de N-metil-D-aspartato (NMDA) (125 mg / kg) o L-metionina sulfoximina (metsox) (250 mg / kg) .Hypoxia y evaluación anoxia de las estadísticas para los experimentos en animales enteros o de los cambios en glutamato cerebral de unión después de la administración de DETC-meso se llevó a cabo mediante el uso de la INSTAT GraphPad programa de software Graph Pad (San Diego, Calif.).

Se aislaron estudios-sinápticos de unión membranas (100 proteínas pg) (YH Lee et al., J. Neurosci. Res., 40, 797-806 (1995)) forman toda homogeneizado de cerebro de ratones Webster suizos macho y se incubaron en 0.1 mm L-glutamato durante 30 minutos a 25 ° C. Después de la adición de 50 nm de [3H] glutamato, la incubación se continuó durante 45 minutos adicionales. Las reacciones se terminaron por centrifugación a 4 ° C. Para separar unida a la membrana de la radiactividad libre. La unión no específica (la radiactividad unida en presencia de 0,5 mM sin marcar glutamato) es de 20-30% de la radiactividad total unida.Hipoxia y anoxia la tasa (k) y máximo porcentaje de obstrucción de (M) de unión por DETC-meso (I) durante el tiempo de incubación (t) glutamato se determinó ajustando la ecuación [% de inhibición] = M (1-e -Kit) a estas día por el uso de la grafit programa (software erithicus ltd.). Esta ecuación se deriva para la inactivación de primer orden por un reactivo específico de grupo que da un efecto parcial. Si “A” es el porcentaje de actividad de unión que queda después de una exposición extensa (t = ∞) del receptor a un exceso de DETC-meso, entonces M = 100-A) e -Kit + A; sustituyendo (100-M) para “A” y [inhibición 100-%] para “a” en esta ecuación da el empleado para propósitos de análisis de datos. El porcentaje máximo de bloqueo de glutamato de unión (M) observó no dependía de la concentración de glutamato empleado en experimentos de unión, de tal manera que los receptores modificados parecían ser “no competitiva” inhibido (independiente de si DETC-meso todavía estaba presente o ausente en el momento en que el glutamato unión se ensayó).Hipoxia y anoxia Una segunda ecuación se utilizó en el análisis de los datos de unión que define inactivación parcial, irreversible de dos grupos distintos de receptores: [% de inhibición] = M 1 (1-e -k 1 IT) + M 2 (1-e -k 2 IT), en donde M 1 y M 2 son la cantidad máxima de inhibición obtenida para la modificación completa de cada población receptor y k 1 y k 2 son las constantes de velocidad para estas modificaciones, respectivamente.

El tratamiento de preparaciones de membranas sinápticas (Y. -H. Lee et al., Supra) a partir de los cerebros de ratones con DETC-meso, resultó en un dependiente del tiempo, parcial, y la pérdida irreversible de su capacidad para unirse glutamato (Fig. 2 ). Seis determinaciones del efecto de DETC-meso se hicieron en cada concentración ensayada (1, 5, 10, 50, 100, 200 y 1000 m) y el valor promedio se muestra con barras de error para una desviación estándar.Hipoxia y anoxia los valores de M y K obtenidos cuando un solo exponencial fue ajuste a los datos fueron 58 ± 7% y 25 ± 10 M -1 s -1, respectivamente, y se muestra la línea calculada mediante el uso de estos valores (-). Una línea discontinua (- – -) que se calculó para una ecuación exponencial doble ajuste a los datos con valores nominales de M 1 = 15%, M 2 = 43%, k 1 = 900 M -1S -1 y k 2 = 8 también se muestra M -1 s -1. Inhibición de la unión de glutamato parece depender de modificación de más de una población de receptores de glutamato, cada uno con una cinética distintas. Aunque un mejor ajuste de estos datos se podría obtener mediante el uso de una ecuación exponencial doble, un ajuste único de esta ecuación a estos datos no se pudo obtener, debido al mayor número de parámetros independientes que participan.Hipoxia y anoxia sin embargo, un ajuste nominal de estos datos indicó que cerca de un cuarto de la inhibición total (M 1 = 15%) se produce a una velocidad mucho más rápida (k 1 = 900 M -1 s -1), que la velocidad (k 2 = 8 M -1 s -1) asociados con la inhibición del resto (M 2 = 43%) (Fig. 2). Dado que el efecto de DETC-meso en cualquiera de población receptor es irreversible, el bloqueo del receptor de glutamato in vivo se puede determinar fácilmente.

Ejemplo 13 •

Para probar si carbamoilación de los receptores de glutamato podrían impedir las convulsiones causadas por los agonistas de glutamato, el efecto de DETC-meso en convulsiones inducidas por análogos de glutamato se examinó.

TABLA 1

Los animales de control

DETC-meso tratada b

El tiempo medio

El tiempo medio

de embargo

de embargo

Tratamiento

(Min)

(Min)

NMDA

16 ± 3

120 una

(125 mg / kg, los ratones)

hipoxia y anoxia

(5/8) una

(0/6) una

MetSOX

127 ± 24

307 ± 60

(250 mg / kg, los ratones)

(8/8)

(6/8) una

MetSOX

136 ± 6

318 ± 60

(250 mg / kg, las ratas)

(4/4)

(4/4)

5 ATA c O 2

24 ± 3

60

(ratones)

(7/7)

(0/5) una

Nimals en el grupo de control fallaron a exhibir ningún convulsiones, incluso después de una segunda inyección de NMDA. Resistencia a las convulsiones inducidas por NMDA parece deberse a P metabolismo de este análogo de glutamato 450 mediada por, basado en la capacidad de N-bencilimidazol, un inhibidor de P 450, para producir la sensibilidad en los animales NMDA-resistentes. Ninguno de los animales en el grupo tratado-DETC-meso (seis de cada seis animales) exhibió ningún convulsiones inducidas por NMDA para la duración del período de observación (2 horas). En el caso #

Del tratamiento metsox, dos de los ocho animales en el grupo tratado con DETC-meso permanecieron libres de crisis durante el período de observación (seis horas) .Hypoxia y anoxia en el caso del oxígeno exposición hiperbárica (5 ATA O 2), todos los animales en el grupo tratado con DETC-meso (cinco de cinco animales) permanecieron libres de crisis durante el período de observación (una hora).

NMDA es un agonista selectivo para un subtipo principal de ionotrópicos (vinculado canales de iones de calcio) receptor de glutamato (N. Burnashev, célula. Physiol. Biochem., 3, 318-331 (1993)). Como se determinó en los resultados ilustrados en las figuras. 2 y 3, el efecto de DETC-meso en la unión a preparaciones de membrana sináptica de glutamato no es una medida de la modificación de DETC-meso de este subtipo de receptor. Aunque hasta el 34% de la capacidad total de glutamato unión de membranas sinápticas es atribuible a los receptores de NMDA (M. Cincotta et al., Anal.Hypoxia y Biochem anoxia., 177, 150-155 (1989)), el efecto del glutamato sobre estos receptores es dependiente de glicina (DW Bonhaus, mol. Pharmacol., 36, 273-279 (1989)), que no se incluyó en los estudios presentados en las Figs. 2 y 3. En las condiciones de estos experimentos, NMDA no bloquea glutamato unión a preparaciones de membrana sináptica. Cuando estos experimentos de unión se repitieron en presencia de glicina (0,1 mm), la obstrucción reversible de la unión a cerebro de ratón preparaciones de membrana sináptica por NMDA glutamato (0,5 mm, 32 ± 2% bloqueo) y la obstrucción irreversible por DETC-meso (0,1 mm, se observó 48 ± 3% obstrucción). El grado similar de inhibición observado por DETC-meso en presencia y ausencia de glicina [48 y 53% (Fig. 2), respectivamente] indica que tanto NMDA y no de NMDA subtipos de receptores de glutamato se ven afectados en un grado similar por carbamoilación. hipoxia y anoxia

Ejemplo 16 •