us20160199393 de Patentes – métodos de tratamiento de la isquemia cerebral o hipoxia – Google patentsuche anoxia cerebral

El accidente cerebrovascular es la principal causa de muerte y discapacidad a largo plazo en los países desarrollados, y representa una carga económica importante en el mundo (Dombovy ML, sandok BA, basford J R. rehabilitación de accidente cerebrovascular:. Una revisión accidente cerebrovascular; un diario de circulación cerebral . 1986;. 17 (4363-9) evidencia sustancial indica que la excitotoxicidad mediada por glutamato es un importante contribuyente a la neuropatología que resulta en víctimas de accidente cerebrovascular (Rothman SM, Olney J W. el glutamato y la fisiopatología de daño cerebral hipóxico-isquémica Anales de. . neurología 1986; 19 (2):. 105-11) Sin embargo, hasta la fecha, el desarrollo de tratamientos clínicos eficaces para esta condición potencialmente devastadora ha sido en gran parte infructuosos, ya que es difícil de inhibir simultaneouslyy los diversos receptores de glutamato y sus enzimas activadas durante una carrera (lai TW, Shyu WC, Wang Y T.Brain anoxia


vías de carrera de intervención: los receptores NMDA y más allá. Tendencias en la medicina molecular. 2011; 17 (5): 266-75). Por lo tanto, es bien aceptado que la inhibición de glutamato extracelular elevada accidente cerebrovascular inducida es más eficaz que la inhibición de todos los receptores de glutamato para la prevención de la excitotoxicidad. Sin embargo, no hay terapias disponibles para este propósito.

Se ha demostrado que la hipoxia o isquemia mediada por reducción de trifosfato de adenosina (ATP) causa el fallo de la función mediada por la energía de na + bombas y conduce a la acumulación de na + iones dentro de las neuronas, lo que contribuye a la despolarización de la membrana celular y exocitosis glutamato (choi DW, Rothman S M. El papel de la neurotoxicidad del glutamato en la muerte neuronal hipóxico-isquémica.anoxia cerebral revisión anual de la neurociencia. 1990; 13: 171-82). Por otra parte, la reducción de ATP-isquémica inducida podría conducir a un colapso de la na K + gradiente + / electroquímica y causar transportadores de glutamato para operar en la dirección inversa (rossi DJ, Oshima T, Attwell liberación D. glutamato en la isquemia cerebral grave es principalmente por captación invertido Naturaleza 2000; 403 (6767):.. 316-21). Un estudio reciente indicó que la cistina-transportador de glutamato (xc sistema -) – la liberación de glutamato extrasynaptic mediada era un mecanismo fundamental para la elevación de glutamato extracelular después de privación de oxígeno y glucosa (Soria FN, Pérez-Samartín A, Martin A, gona KB, llop J ., Szczupak B, et al liberación de glutamato a través de extrasinápticos antiporter cistina / glutamato contribuye a isquémica damage.Brain anoxia el journal of Clinical Investigation 2014; 124 (8):. 3645-55). Estos mecanismos han contribuido a un flujo de salida de glutamato rápida y transitoria y excitotoxicidad durante la hipoxia o isquemia. Sin embargo, el aumento en los niveles extracelulares de glutamato no era un evento transitorio y, en seres humanos, se ha registrado para hasta 4 días después del accidente cerebrovascular isquémico agudo (Dávalos A, Castillo J, serena J, noya M. duración de la liberación de glutamato después del accidente cerebrovascular isquémico agudo .. Stroke; un diario de circulación cerebral 1997; 28 (4): 708-10), lo que sugiere otros mecanismos desconocidos puede estar implicada en la elevación a largo plazo de glutamato extracelular y la excitotoxicty resultante.

el factor 1 inducible por hipoxia (HIF-1) es un regulador clave en la hipoxia y, debido a las funciones de sus genes aguas abajo, ha sido sugerido para ser un mediador importante en los resultados neurológicos después del accidente cerebrovascular (shi H.Brain anoxia factor inducible por hipoxia 1 como una diana terapéutica en el ictus isquémico química médica actual 2009; 16 (34):.. 4593-600). Si bien se discute el papel de HIF-1 después del accidente cerebrovascular, HIF-1α fue hasta reguladas después de la isquemia cerebral y reperfusión (CIR) y en su mayoría situado en la penumbra, el tejido salvable (Bergeron M, yu AY, solway KE, Semenza GL, agudo F R. inducción de hipoxia-inducible factor-1 de sus genes diana siguientes isquemia focal en cerebro de rata (HIF-1) y The european journal of Neuroscience 1999; 11 (12):.. 4159-70). Curiosamente, la activación de HIF-1 se podría aumentar rápidamente dentro de 1 h después de la CIR y duró hasta 7-10 días (Bergeron M, yu AY, solway KE, Semenza GL, agudo F R. inducción de la hipoxia-inducible factor-1 de sus genes diana (HIF-1) y después de una isquemia focal en cerebro de rata.anoxia cerebral el European Journal of Neuroscience. 1999; 11 (12): 4159-70: Baranova O, miranda LF, pichiule P, dragatsis I, Johnson RS, la inactivación J C. específica de neurona chavez del factor inducible por hipoxia 1 alfa aumenta la lesión cerebral en un modelo de ratón de transitoria focal cerebral isquémico. The Journal of Neuroscience: la revista oficial de la Sociedad de Neurociencia. 2007; 27 (246320-32), lo que sugiere esta señalización juega un papel en la regulación de los acontecimientos tempranos y tardíos de la lesión cerebral y la recuperación después del accidente cerebrovascular. HIF-1 contribuye al control vasomotor, angiogénesis, eritropoyesis, metabolismo del hierro, la proliferación celular / control del ciclo celular, la muerte celular, y metabolismo de la energía a través de la regulación de una amplia gama de genes después de CIR (agudo F R, Bernaudin M.anoxia cerebral HIF1 y oxígeno de detección en el cerebro. Naturaleza Reviews Neuroscience. 2004; 5 (4437-48). Sin embargo, todavía no está claro si HIF-1 juega un papel en la regulación de la homeostasis del glutamato.

RESUMEN•

Todos los animales fueron tratados de acuerdo con las directrices institucionales de la Universidad Médica de China y aprobados por los comités de cuidado y uso de animales institucionales de la Universidad Médica de China. C57BL / 6J utilizados para de tipo salvaje fueron adquiridos de las instalaciones de animales del consejo nacional de ciencia (NSC), XCT knockout homocigóticos (XCT – / -) ratones de 129 / SVJ-C57BL / 6J mezcla de antecedentes genéticos y su genotipado eran tan descrito previamente (Sato H, Shiiya a, Kimata H, Maebara K, tamba M, Sakakura Y, et al desequilibrio redox en cistina / transportador de glutamato deficientes anoxia mice.Brain la revista de química biológica 2005:.. 280 (45): 37423-9, que se incorpora aquí por referencia), XCT – / – ratones proporcionado amablemente por el Dr. Hideyo sato. Estos animales fueron utilizados para el aislamiento de primarias corticales células, neuronas y astrocitos, rodajas de cerebro, modelos CIR, microdiálisis, biodistribución y los estudios de imagen de tomografía por emisión de positrones (PET). Las ratas macho adultas Sprague-Dawley (250-300 g, el animal. Facilidad de la NSC) también se utilizaron para los modelos CIR, formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) y los estudios de comportamiento.

Primaria células corticales, neuronas y astrocitos preparación •

Las células se lisaron en un tampón de homogeneización que contiene pepstatina (1,45 leupeptina (2,1 mm), ditiotreitol, trietanolamina (50 mm), y ácido etilendiamina tetraacético / etilenglicol tetraacético (0,1 mm), proteína total (5-20 mg) se cargó en tampón de Laemmli en un gel de apilamiento de poliacrilamida al 7,5% y correr a 40 V y a continuación, 100 V a través de un gel de separación 7,5% usando un mini celda (Bio-Rad).anoxia cerebral las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad no. 162 a 0.146) durante 1 h usando un mini celda de transferencia electroforética trans-blot (Bio-Rad) a continuación, la membrana se bloqueó en 13 PBS / 0,05% de polisorbato 20/5% leche descremada en polvo durante la noche a 4 ° C. Después de 2 lavados en 13 PBS / 0,005% de polisorbato 20, se añadió el anticuerpo monoclonal durante 1,5 h. Después de otros 3 lavados, se añadió el anticuerpo secundario durante 1,5 h. El uso de un kit de quimioluminiscencia (Amersham Life Science no. RPN2106), la membrana se desarrolló en una película Kodak en el cuarto oscuro. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: ß-actina (Sigma-Aldrich, 1: 10.000 de dilución) y XCT (. Novus o inc genetex, dilución 1: 1000).

• imágenes de inmunofluorescencia

anoxia cerebral

La actividad de cistina antiporter / glutamato se realizó utilizando –dependent cl [14C] ensayo de absorción de L-cistina como se describe anteriormente (Soria FN, Pérez-Samartín A, Martin A, dona KB, llop J, Szczupak B, et al. Extrasinápticos la liberación de glutamato a través de antiporter cistina / glutamato contribuye al daño isquémico El journal of Clinical Investigation 2014; 124 (8):.. 3645-55, que se incorpora aquí por referencia). Brevemente, cortes de cerebro o células corticales primarios se incubaron con 0,8 m [14C] L-cistina (PerkinElmer) a 37 ° C durante 10 minutos. La absorción se terminó por el rápido aumento de las células dos veces con tampón de absorción no marcado enfriado con hielo. Las células después se lisaron mediante la adición de 0,8 ml de 0,2 N NaOH que contienen 1% SOS para la determinación de la radiactividad utilizando un analizador de centelleo líquido B2910TR tri-atuendo (PerkinElmer) .Brain anoxia brevemente, rodajas de cerebro o células corticales primarios se incubaron con 0,8 m [14C ] L-cistina (PerkinElmer) a 37 ° C durante 10 min. La absorción se terminó por el rápido aumento de las células dos veces con tampón de absorción no marcado enfriado con hielo. Las células después se lisaron mediante la adición de 0,8 ml de 0,2 N NaOH que contienen 1% SOS para la determinación de la radiactividad utilizando un analizador de centelleo líquido B2910TR tri-atuendo (PerkinElmer).

El glutatión ensayo de detección •

Después de la isquemia, los cerebros de ratas se fijaron por perfusión con solución salina y 4% de paraformaldehído. Después de cerebros habían sido congelados en hielo seco, una serie de secciones adyacentes 10-m de espesor se cortaron en el plano coronal con un criostato. MRI se realizó en ratas bajo anestesia en un sistema de imagen eléctrica general (R4; GE) en 3,0 T.anoxia cerebral cerebros fueron escaneados en 6-8 cortes de imagen coronal, cada uno de 2 mm de espesor sin huecos. secuencias de pulsos de formación de imágenes ponderadas en T2 se obtuvieron con el uso de una técnica de espín-eco (tiempo de repetición, 4.000 ms; tiempo de eco, 105 ms) y se capturaron de forma secuencial para cada animal a las 1, 7, y 28 días después de la isquemia cerebral. Para medir el área de infarto en el córtex derecho, el área no infartada se restó en la corteza derecha desde la zona cortical total del hemisferio izquierdo. El área de infarto se extrae manualmente de la rebanada de cortar, y después el volumen se calculó por el software interno análisis del volumen (voxtool; GE) (Shyu WC, lin SZ, Chiang ME, Chen DC, su CY, wang HJ, et al. Secretoneurin promueve la neuroprotección y plasticidad neuronal a través de la vía JAK2 / STAT3 en modelos murinos de accidente cerebrovascular.anoxia cerebral el Journal of Clinical Investigation. 2008; 118 (1): 133-48, que se incorpora por referencia).

las mediciones del comportamiento neurológicos •

A continuación, los cultivos primarios de neuronas y astrocitos fueron expuestos a OGDR. Las figuras. niveles 10A y 10B muestran mRNA XCT y proteínas en las neuronas con o sin HIF-1α o HIF-2α knockdown 24 h después de OGDR, respectivamente. Las figuras. niveles 11A y 11B muestran mRNA XCT y proteína en astrocitos con o sin HIF-1α o HIF-2α knockdown 24 h después de OGDR, respectivamente. * P es 0,001 en comparación con el control sin OGDR, t-test de Student. P es 0,001 en comparación con OGDR con scramble shRNA (SCR.), T-test de Student. En las figuras. 10A a 11B, las columnas de “OGDR – / shrnas-” muestran los resultados de las muestras no tratadas con tanto OGDR y shrnas.Brain anoxia las columnas de “OGDR -. / ShRNAs scr” muestran los resultados de las muestras no tratadas con OGDR pero tratados con shRNA revueltos. Las columnas de “scr OGDR + / shRNAs.” Muestran los resultados de las muestras tratadas con tanto OGDR y revueltos shRNAs. Las columnas de “OGDR + / shRNAs HIF-1α” muestran los resultados de las muestras tratadas con tanto OGDR y shRNA de metas de HIF-1α. Por último, las columnas de “OGDR shRNAs HIF-2α” muestran los resultados de las muestras tratadas con ambos. OGDR y shRNA de metas de HIF-2α.

Para determinar la activación in vivo de NMDAR, los ratones fueron inyectados con 18F-FSAG a las 12 h después de la reperfusión ex vivo para estudios de biodistribución y los estudios de imagen de tomografía por emisión de positrones (PET). HIGO. La figura 25 muestra la acumulación de guanidina alquiltiofenilo marcado con 18F en los hemisferios cerebrales ipsilateral y contralateral de WT y XCT – / – ratones con CIR a las 12 h después de la reperfusión. * P es de 0,01 en comparación con WT con vehículo, t test.Brain-anoxia estudios ex vivo de los estudiantes de biodistribución en tejidos cerebrales mostraron que la radiactividad de unión de 18F-FSAG a NMDAR fue significativamente mayor en el hemisferio cerebral ipsilateral comparado con el hemisferio cerebral contralateral. Hubo una disminución significativa en la unión de 18F-FSAG a NMDAR en XCT – / – ratones en comparación con ratones de tipo salvaje. Además, de tipo salvaje y XCT – / – ratones tratados con MK801 mostraron una reducción significativa en la acumulación de 18F-FSAG en los hemisferios ipsilaterales y contralaterales en comparación con los ratones con vehículo. Este resultado indicó la especificidad radioligando para la visualización de activación NMDAR in vivo.